Okunma Sayısı: 3401

Tüp Bebek Laboratuar Uygulamaları

Rutin Sperm Analizi
1-Hastadan steril bir kaba (tercihen 3-4 günlük cinsel perhizle) ejekülat (semen) alınır. Alınan ejekülat (semen) örneği 15-30dk. (likefaksiyon süresi; örneğin incelenebilmesi için gereken sıvılaşma süresi) 

37C sıcaklıktaki bir dolap (etüv) içerisinde bekletilir. Daha sonra örnekteki sperm sayısı, hareketliliği ve morfolojik (şekilsel) özellikleri değerlendirilir.

2-Değerlendirmeyi takiben semen örneği yıkama işlemine alınır. İki aşamadan oluşan bu işlem yaklaşık 35-40 dk. sürer. İşlemin amacı semen örneği içerisindeki sperm hücrelerinin diğer seminal plazma hücrelerinden (döküntü hücreleri) arındırılması ve sperm hareketlerinin arttırılarak döllemeye hazır hale getirilmesidir.

Aşılama

Yıkama işlemi sonrasında hazırlanan örnek sperm hareketlerinin arttırılması amaçlı 37C sıcaklık ve %6CO2 (karbondioksit) (yapay vücut ortamına benzer ortam) içeren özel dolaplar (inkübatörler) içerisinde yaklaşık 30dk.bekletilir. Bu süre sonunda spermler bir enjektör yardımıyla kadının rahmine enjekte edilerek hareketliliği arttırılmış spermlerin katedecekleri yol kısaltılmış olur.

Aşılamada gebelik oranları çiftin kısırlık sebebine, kadının yaşına, stimülasyon protokolü (ilaç tedavisi) sonucunda oluşan folikül (yumurtanın içerisinde geliştiği hücreler) sayısına ve sperm parametrelerine bağlı olarak %15-25 arasında değişkenlik gösterir.

Tüp bebek-Mikroenjeksiyon

Hastaya tüp bebek yada mikroenjeksiyon (ICSI-Intra sitoplazmik sperm enjeksiyonu) uygulamasının kararı infertilite (kısırlık) sebebine, toplanan oosit (yumurta) sayısına ve sperm özelliklerine bağlı olarak belirlenir. Tüp bebek ve mikroenjeksiyon uygulamalarında hasta açısından uygulanması gereken prosedürler benzer olmakla birlikte IVF laboratuarında yapılan işlemler farklıdır. Tüp bebekte anne adayından alınan yumurtalarla baba adayından alınan spermler özel bir kültür sıvısına birlikte koyularak inkübatör adı verilen özel dolaplar (yapay vücut ortamı sağlamak için 37C ve %5-6 karbondioksit içeren ortamlar) da 14-16 saat bekletilir ve bu süre sonucunda sperm hücrelerinin yumurtaları döllemeleri beklenir. Mikroenjeksiyonda ise tüp bebekten farklı olarak her bir yumurtanın içerisine tek bir sperm hücresi mekanik olarak yerleştirilir. Böylece spermin yapacağı göreve mikromanüplatör adını verdiğimiz aletler yardımcı olmuş olur. Günümüze kadar yapılan çalışmaların çoğunluğu tüp bebek ve mikroenjeksiyon sonrasında benzer gebelik ve implantasyon (transfer edilen embryo başına rahme tutunabilen embryo sayısı) oranlarının elde edilebildiğini göstermiştir.

Tüp Bebek

1-Yumurta toplama işlemi sonrasında yumurtalar özel kültür solüsyonları içerisinde 37C sıcaklık ve %6CO2 içeren özel inkübatörlerde matürasyonlarını (olgunlaşma) tamamlamak için 3-5 st.inkübe edilir.

2-Bu süreç içerisinde semen örneği yıkanarak işleme hazır hale getirilir ve dölleme işlemi yapılana kadar 37C sıcaklık ve %6CO2 içeren inkübatörlerde bekletilir.

3-Süre bitiminde hazırlanan sperm örneğinden; sayı ve hareketliliğe bağlı olarak belirlenen bir konsantrasyonda oositlerin(yumurtaların) kültüre edildiği ortama bırakılır ve 14-16 saat döllenme işleminin gerçekleşmesi için 37C sıcaklık ve %6CO2 li ortamda inkübe edilir.

4-Bir gün sonrasında yumurtalar çevrelerindeki hücrelerden arındırılarak döllenme kontrolü yapılır.Yumurta içerisinde dişi ve erkek çekirdeğinin gözlenmesi döllenme göstergesidir.

Mikroenjeksiyon

1-Yumurta toplama işlemi sonrasında oositler kültür solüsyonları içerisinde matürasyonlarını tamamlamak amaçlı 2-3 saat 37C sıcaklık ve %6CO2 içeren inkübatörlerde bekletilir.

2-Bu süre içerisinde semen örneği hazırlanır.

3-Süre bitiminde yumurta çevresindeki hücreler mikroskop altında temizlenerek matürasyonları kontrol edilir. Genel dünya istatistiklerine göre toplanan yumurtaların %70-75 inin matür (olgun) olmaları gereklidir. Sadece olgun yumurtalara işlem yapılmalıdır. (İmmatür-olgun olmayan oositlerden özel kültür ortamlarında 2-24 saat içerisinde olgunlaşabilmiş olanlarına mikroenjeksiyon işlemi uygulanabilir. Fakat bu süreç içerisinde oositler canlılık kaybına uğrayabildikleri için elde edilebilen embryolarla gebelik oranları daha düşüktür.)

4-Oositler çevrelerindeki hücreler temizlendikten sonra 1-2 saat daha 37C sıcaklık ve %6CO2 içeren inkübatörlerde bekletilmeye devam edilir ve mikroenjeksiyon işlemi yapılır. Mikroenjeksiyon işleminin tüp bebekten en belirgin farkı mikroskop altında özel mikromanüplatörler yardımıyla tek bir spermin tek bir oosit içerisine mekanik olarak yerleştirilmesidir. Daha sonraki döllenme ve embryo gelişim aşamaları benzerdir.

5-Döllenmeyi takiben 24 saat içerisinde yumurtalar 2-4 hücreli aşamaya 72. saatte 6-8 hücreli aşamaya 96. saatte morula adı verilen çok hücreli aşamaya ve5-6. günlerde ise embryonun rahme tutunmadan önceki son aşaması olan blastokist aşamasına ulaşabilirler. Döllenmiş yumurtalar 24. saatte bölünme aşamasına geçtikten itibaren morfolojik yapıları mikroskop altında incelenerek belirli bir sınıflandırma yöntemi ile kaliteleri gruplandırılır. Bu sınıflandırmada embryonun o günki olması gereken hücre aşaması (klivaj hızı), hücrelerin birbirine olan eşitliği, fragmantasyon adı verilen embryo ileri gelişimini olumsuz yönde etkilediği gösterilmiş hücre içi atipik yapıların embryo içerisinde bulunma yüzdesi, hücre içi görünümünün parlaklık ve homojenliği gibi özellikler dikkate alınır. Bu değerlendirmelere göre en iyi kalitedeki embryolar o günki olması gereken bölünme aşamasına ulaşabilmiş, hücre büyüklükleri birbirine eşit ve homojen görünümlü, hiç fragmantasyon içermeyen embryolardır. (G1 embryo) G2 embryo:G1'den farklı olarak %20'nin altında fragmantasyon içeren; G3 embryo hücreleri birbirine eşit olmayan %20-50 fragmantasyon içeren ; G4 embryo ise hücreleri eşit olmayan %50'nin üzerinde fragmantasyon içeren embryolardır. Yapılan çalışmalar G1-G2 embryoların transferi ile bu embryoların gelişim potansiyellerinin daha yüksek olmasına bağlı olarak gebelik oluşma şansının G3-G4 embryoların transferine göre daha yüksek olduğunu göstermiştir. Bunun yanında G1 ve G2 arasındaki oranla G3 ve G4 arasındaki oranlar benzerdir. Embryolar blastokist aşamasına ulaştıklarında kendi aralarında kalitelerine göre tekrar sınıflandırılırlar. Bu sınıflandırmada blastokistin gelişim hızı ve iç hücre tabakasının yapısı dikkate alınır. Bu gruplandırmaya göre iyi kalitede blastokistler BG1-BG2 (BG1 ve BG2 arasındaki tek fark BG1 blastokistlerin daha hızlı gelişmesidir.); Kötü kalitede blastokistler ise BG3 olarak adlandırılır. BG1-BG2 blastokistlerin gebelik oluşturma şansları BG3 blastokistlere göre daha yüksektir. BG1 ve BG2 arasındaki fark ise benzerdir.

6-Embryo transferi embryo gelişiminin 2-6. günleri arasında yapılabilir. Günümüze kadar yapılan çalışmalar halen çelişkili olmakla beraber transfer gününe göre gebelik oranları benzerdir.

Blastokist Transferi

Blastokist döllenmiş yumurtanın ana rahmine tutunmadan ulaşmış olduğu son gelişim safhasıdır. Embryonun çapı blastokist aşamasına ulaşırken giderek büyür ve dış kılıf incelir. Blastokist dış kılıfından sıyrılarak (hatched blastokist) rahmin iç tabakasına tutunur ve gebelik oluşturur. Günümüz kültür ortamlarında embryoların ancak ortalama %45'i bu aşamaya ulaşabilmekte bu blastokistlerinde ancak %15-20'si hatched aşamaya kadar gelişimini devam ettirebilmektedir. Bu oranlar bölünme aşamasındaki embryolar kötü kalitede olduğunda dahada düşmektedir. Bu sebeplerden dolayı blastokist transferi günümüz şartlarında ancak selektif hasta gruplarında uygulanması durumunda gebelik şansını arttırabilmektedir. (En fazla kabul gören endikasyonlar: En az iki başarısız IVF-ICSI siklusu olan ve embryo gelişiminin son aşamaya kadar daha dikkatli gözlenmesi gereken hastalar, çoğul gebelik riski yüksek, genç ve fazla sayıda embryosu olup gelişim potansiyeli yüksek embryoların (blastokist) seçilebilip daha az sayıda embryo transferi gerektiren hastalar)

Embryo Dondurma

Embryoların koruyucu kültür solüsyonları (krioprotektanlar) içerisinde dengelendikten sonra özel bir alet ile kademeli olarak soğutularak dondurulması ve sıvı nitrojen (-196C) içerisinde depolanması işlemlerini içerir. Embryo kalitesine ve hasta yaşına bağlı olarak transfer edilecek embryo sayısı 2-4 arasında değişebilir. Hastanın transfer sonrasında (yada olumsuz klinik bulgulardan dolayı o siklusta hiç transfer yapılmadan) iyi kalitede daha fazla sayıda embryolarının bulunması durumunda tekrarlayan siklusta transfer edilmek üzere bu embryolar dondurulabilir. En iyi kalitede embryolar dondurma işleminden minimal zarar göreceğinden dolayı (Dondurma çözme sonrasında embryolarda canlılık oranı;%75-%90) sadece iyi kalitede embryolar dondurulur. Kötü kalitedeki embryoların dondurulması durumunda yaşama olasılıkları çok düşüktür (%20-%25). Dondurma işlemi transfer edilecek embryoların seçimi sonrasında 2-6. Gün arasında yapılabildiği gibi döllenmenin gerçekleştiği günde uygulanabilir. Dünya istatistiklerine göre dondurulmuş embryoların çözme sonrası transferi ile gebelik oranları %25-50 arasında değişmektedir. Bu oranlar klinik ve laboratuar prosedürlerine, hasta yaşına, infertilite sebebine, çözülen embryo başına canlılık oranına göre değişkenlik göstermektedir.

Testis Biopsisi

Ejekülatında hiç sperm hücresine rastlanmamış (Azospermi) yada ejekülat spermlerinin hepsinin yada en az %80 inin ölü olduğu hastalarda sperm hücreleri sperm üretiminin kaynağı olan testislerde yada epididimde (kanallarda) aranır.

-Azosperminin sebebi kanallarda (epididim) tıkanıklık (obstrüktif azoospermi) ise kanallardan aspire edilen sıvı içerisinde laboratuvarda mikroskop altında spermin varlığı araştırılır. (MESA- mikroepididymal sperm aspirasyonu yada farklı bir yöntem olan PESA-perkütan epididiymal sperm aspirasyonu) Kanallarda sperm hücresine rastlanmazsa testis biopsisine geçilir.

-PESA/MESA'da sperm bulunamayan olgularda yada azoospermi sebebi direkt olarak testis (yumurtalık) teki üretim bozukluğuna bağlı olan hastalarda (non-obstrüktif azoospermi) sperm hücresinin varlığı kanallardan alınan sıvı (epididim) yerine testisten parça alınarak araştırılır.

-Testis biopsisi esnasında alınan doku parçası laboratuarda mikroskop altında incelemeye alınır.

-Doku parçası alınmış ise parça laboratuarda tamamıyla ayrıştırılarak olası sperm hücrelerinin açığa çıkması sağlanır.

-İnceleme bitiminde örnek yıkama işlemine alınır. Bu işlem iki aşamadan oluşup sperm sayısına göre 35-45dk. arasında sürebilir.

-Testis biopsisi işlemi eşin yumurtalarının toplandığı gün yapılabileceği gibi 24st. öncesindede uygulanabilir. 24st. öncesinde yapılması durumunda IVF laboratuarında yıkanarak hazırlanan örnek 37C sıcaklık ve %6CO2 içeren (amaç yapay vücut ortamı yaratmaktır) inkübatörlerde mikroenjeksiyon işlemine kadar inkübe edilebilir. Testis spermleri olgunlaşmamış hücreler olduğundan henüz hareket kabiliyetlerini kazanmamış olabilirler. Bu sebeple doku parçasının 24 saat önce alınması ve yıkanan örneğin inkübatörlerde bekletilmesi sperm hareket faaliyetinin başlaması açısından da yararlı olabilir.

Preimplantasyon Genetik Tanı( PGT)

PGT'nin yardımcı üreme teknikleri arasında şu ana kadar kabul gören ana endikasyonları; ileri yaş (38 yaş ve üstü), tekrarlayan başarısız IVF-ICSI denemeleri, tekrarlayan düşükler ve kalıtımsal genetik bozukluklardır. Yapılan çalışmalar bu hasta gruplarında (selektif) yöntemin uygulanması durumunda genetik olarak sağlıklı embryoların seleksiyonu ile daha yüksek gebelik oranlarının elde edilebileceğini savunmaktadır. PGT'nin IVF-ICSI (tüp bebek-mikroenjeksiyon) siklusuna giren her hastaya (non-selektif) uygulanması durumunda gebelik oranlarını arttırabildiğini gösteren bir çalışma henüz yayınlanmamıştır.

-Hastaya uygulanacak genetik tanıya bağlı olarak yumurtaların toplandığı gün yumurtadaki genetik materyalin bulunduğu 1. kutup cisimciğinden ,döllenmiş oosite ait 1.ve 2. Kutup cisimciğinden, çoğunlukla embryo gelişiminin 6-8 hücreli aşamasında yada blastokist aşamasında uygulanabilen bir yöntemdir.

-Genetik analiz prosedürleri esnasında yabancı hücrelerden kaynaklanabilecek kontaminasyon riskinden dolayı PGT uygulanacak hastalarda ICSI tercih edilir.

-Genetik analiz işleminin embryo aşamında uygulanabilmesi için embryoların 72.st.te en az beş hücre içermeleri gerekir.

-Bu aşamaya ulaşabilmiş embryolardan bir yada iki hücre IVF laboratuarında özel mikromanüplatörler yardımıyla mikroskop altında çıkartılır. Embryodan hücre çıkartılmasını kolaylaştırmak amaçlı biopsi öncesinde embryolar içerdikleri hücreler arası bağları gevşeten özel solüsyonlar (Ca-Mg free solüsyonlar) içerisinde bekletilir (Biopsi işlemin doğru ve dikkatli yapılması durumunda embryonun ileri gelişimine olumsuz bir etkisinin olmadığı yapılan bilimsel çalışmalarla gösterilmiştir.)

-Alınan hücreler inceleme için genetik laboratuarına aktarılır. İnceleme 1-2 gün sürebilir.

-Genetik analizin sonuçlanması ve transfer edilecek sağlıklı embryoların tespit edilmesi durumunda embryo transferi analizin yapıldığı yumurta yada embryo aşamasına bağlı olarak 3-5. günler arasında yapılabilir.

Assisted Hatching (Destekli Yuvalama)

Yardımcı üreme tekniklerinde kabul gören assisted hatching endikasyonları: ileri yaş (35 yaş ve üstü), en az bir kez tekrarlayan başarısız IVF-ICSI siklusu, yüksek bazal hormonal değerler, embryo dış kılıfının normalden daha kalın olması ve kötü embryo kalitesidir. Yöntem selektif olarak bu hasta gruplarında uygulandığında gebelik oranlarını arttırabilir. Bu endikasyon gruplarına dahil olmayan hastalara uygulanması durumunda gebelik oranları üzerinde etkisinin olmadığı yapılan çalışmalarla gösterilmiştir.

Normal gelişimini tamamlayabilen bir embryo rahmin iç tabakasına tutunmadan önce dış kılıfından sıyrılabilmelidir. Destekli yuvalama işleminde amaç embryonun dış kılıfını transfer öncesinde bir miktar inceltebilmek böylelikle rahme tutunmasını kolaylaştırarak gebelik şansını arttırabilmektir. Bu işlem embryo gelişiminin farklı aşamalarında uygulanabilir (2-5.gün). Yapılan bilimsel çalışmalar henüz ilk bölünme safhasını yeni tamamlamış 2 hücreli embryolarda assisted hatching işleminin hücre ileri gelişimini olumsuz yönde etkileyebileceğini göstermiştir. Bu sebeple assisted hatching işlemi 2 hücreli embryolara uygulanmaz. Destekli yuvalama IVF laboratuarında farklı metodlarla uygulanabilir. Ör: Lazer ışınları kullanarak, asidik solüsyonlarla eriterek yada sivri pipetler yardımıyla keserek. Yapılan bilimsel çalışmalarda farklı yöntemlerde benzer gebelik oranları bildirilmiştir. Günümüzde laser assisted hatching yönteminin en hızlı- pratik yöntem olması ve minimal düzeyde kullanıcı tecrübesi gerektirmesi en yaygın olarak kullanılmasına sebep olmaktadır. Bio Başak Balaban